細胞培養是細胞生物學研究的第一步。在細胞培養過程中，為了確保細胞的健康生長，實現下游實驗的順利進行，研究人員需要測定細胞生長曲線，了解其生長情況，因而在細胞培養過程中及實驗前都需要用細胞計數儀對細胞樣品進行計數，檢測活率和濃度。細胞計數的常見方法包括：手動計數及自動計數。本文將為您詳述這兩種計數方法，并對其進行優劣勢對比。

一.手動細胞計數

18世紀，由法國解剖學家和組織學家 Louis-Charles Malassez發明的血球計數板人工手動活細胞計數方法一直被視為細胞計數的金牌標準。

手動細胞計數操作流程：

1.收集細胞并染色

收集細胞懸液，使用準備好的臺盼藍或AO/PI染料對細胞進行染色。

2.清潔計數板

取出血球計數板，用清水沖洗表面，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風機吹干，或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其干燥。

3.蓋上蓋玻片并上樣

將清潔干燥的血球計數板平置于臺面上，加蓋專用的蓋玻片形成計數室，用移液器吸取細胞懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓樣品自動緩慢滲入，一次性充滿計數室并均勻分布，防止產生氣泡。

4.顯微鏡觀察定位

在顯微鏡下找到合適的視野，對細胞樣品進行觀察，通過調焦讓視野清晰，找到目標方格。如使用AO/PI染料，應使用熒光顯微鏡進行觀察。

計數板的計數面積

5.鏡下手動計數

通過移動不同視野，重復計數3次。

6.統計濃度并計算

根據換算公式和已經記錄的數據，計算樣品中的細胞濃度，如果是臺盼藍染色的細胞要將活細胞和總數分開計數。

7.清潔血球計數板

同上述方法清潔血球計數板后留作下次使用。

應用范圍：

低通量/頻率細胞計數

注意事項：

1、不完全清潔的血球計數板可能會導致生物安全問題

2、由于血球計數板的材質問題，表面易造成劃痕嚴重影響實驗結果

3、雜質殘留易造成細胞分布不均

4、清潔劑殘留可能會影響細胞活性

5、少量聚團細胞按照一個細胞計數，聚團較多的樣品需要重新吹打混勻再重新計數

6、關于壓在刻線上的細胞的計數原則要提前規定好

二.自動細胞計數

血球計數板計數雖被視為細胞計數的金標準，但由于血球計數板計數自身設計及使用方法，導致計數存在一些固有問題。為了消除這些問題， 自動細胞計數儀應運而生。

常見的自動細胞計數儀有三種：分別是圖像式自動細胞計數儀、庫爾特式自動細胞計數儀以及流式細胞儀。其中圖像式細胞計數儀由于計數快速且原理最接近金標準的人工多次手工計數的結果，其原理通過儀器對細胞樣品的圖像識別，從而對細胞濃度和大小等參數運用算法進行自動快速的分析。進而可以了解細胞的生活狀態和鑒別細胞死活，確定細胞接種濃度和數量以及了解細胞存活率和增殖度。

自動細胞計數儀計數操作流程

應用范圍：

自動細胞計數儀可以根據不同的實驗場景搭配相應的熒光通道進行計數。

注意事項：

• 根據實際樣本進行圈選參數設置

• 已稀釋樣品計數需提前設置預稀釋倍數

• 復雜樣品需檢查成像焦距是否設置正確，如有偏差及時微調修正

手動 VS 自動

優點缺點對比

總結：

手動細胞計數——血球計數板計數可能造成數據誤差，且對血球計數板不規范的清洗操作可能造成生物危害。

自動細胞計數——計數精準，速度更快，可以提高實驗效率。此外可以在機器本身拓展熒光功能，應用范圍更廣。

此外，USP-NF（美國藥典）建議至少選用兩種及以上方法對復蘇后的細胞進行活率檢測，除了明場下臺盼藍染色外，常用AO/PI染色法在熒光光場下進行活細胞計數，因此帶有熒光功能的自動細胞計數儀則可更方便對細胞樣品進行快速明場檢測和熒光檢測，所以使用自動化的儀器進行細胞計數更加適用于目前的細胞生物學研究場景。

瑞沃德自動細胞計數儀

瑞沃德自動細胞計數儀可配合多熒光通道，對懸液中的細胞進行定量分析，并同時顯示明場及熒光圖像，清晰呈現計數結果及細胞形態；可實現9秒快速計數，省時省力。

同時為了滿足細胞治療和生物制藥的需求，C100-Pro軟件系統的數據管理和控制性能完全符合FDA 21 CFR Part11。適用于細胞治療、生物制藥、免疫學及疫苗開發、腫瘤研究、干細胞及代謝研究等研究領域的細胞分析。