二氧化碳培養箱細胞復蘇流程，首先從液氮罐中取出凍存細胞，放入37℃水浴鍋中融化，輕柔離心后收集細胞沉淀。其次緩慢用移液槍吸去上清，加入適量濃度和體積的完全培養基，重懸細胞沉淀，轉移至細胞培養皿或細胞培養瓶。然后根據細胞培養皿或者培養瓶的體積，補足完全培養基，放入二氧化碳培養箱中培養觀察。

細胞培養復蘇操作中的注意事項和技巧

一、小心取出凍存管

許多小型液氮罐的設計是將細胞凍存在帶蓋的提籃中，提籃會浸沒在液氮中。由于提籃中沒有孔格的劃分，細胞凍存管無法擺放整齊。取用細胞時候，實驗人員經常需要逐一查看，尋找計劃復蘇的細胞，此過程耗時過久，可能會導致其他凍存管內的細胞受損。

一般大型液氮罐會配置成列的凍存架和細胞存儲盒，取出凍存架和放回都需要平穩小心處理，避免帶出大量液氮。罐內液氮較多時，可適當在罐口附近停留，等大部分液氮回流后再拎出。

二、快速融化待復蘇細胞

當找到準備復蘇的凍存管后，不要著急放入水浴鍋，先檢查封口膜是否完整（關于凍存細胞時，是否用封口膜的問題，有經驗的呢，都會發現加不加都一樣的），如果貼了醫用膠布，膠布是否有破損？因為一旦凍存管中有液氮流入，直接放入水浴鍋中，管內壓力驟升，可能導致凍存管炸裂，危及實驗人員。推薦使用內旋的凍存管，不宜爆炸。如果只有外旋的凍存管，取出后應盡快倒置/水平放置數十秒，使得液氮流出。

復蘇細胞的核心技術，簡而言之就是快融。從液氮罐中取出的細胞，需及時放入37℃水浴鍋，進行快速融化，期間需不停地輕柔搖晃凍存管。最好在兩分鐘內完全融化細胞。出于衛生考慮，有些細胞房沒有水浴鍋，所以很多復蘇操作，需要在不同實驗室進行。如果兩個實驗室距離較遠，且實驗室室溫較高，可提前準備一只干凈的燒杯，裝入37℃的水作中間緩沖。

注意，復蘇時不要讓水浴鍋中的水，流入凍存管中造成污染。要格外注重無菌操作，經水浴鍋融化后，需對凍存管消毒。最好同時更換手套和口罩，全程避免移液器接觸管口及管壁。小妙招：將凍存管放入無菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。

三、輕柔收集細胞

收集細胞前，要將所用培養基提前預熱并擺放整齊，避免現用現配耽誤復蘇進程，及時讓剛復蘇的細胞接觸正常的生長環境。若凍存液中存在DMSO，請根據所用細胞對其敏感的程度，判斷要不要離心棄除。離心目的，一個是去除DMSO，一個是去除死細胞。

剛復蘇的細胞狀態比較脆弱，應避免多次吹打和離心。比如原代細胞在復蘇融化后，盡量不要進行離心操作，直接補足培養基，使細胞分散均勻，等3-6小時，細胞貼壁后，進行換液處理。此方式也適用于其他凍存狀態一般的細胞。

四、培養前，計數&活力檢測

復蘇過程中，細胞計數必不可少。原則上，凍存前和復蘇后，都需要用細胞計數儀對細胞進行計數和活率分析，判斷凍存的效果和細胞復蘇后的狀態。

五、支原體或細菌的污染

分離培養物，檢測支原體。清潔支架或培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。建議使用的培養基提前用一次性真空過濾器過濾一下，能有效除去支原體、細菌等，0.1μm的過濾器可以去除支原體，0.22微米去除細菌。

復蘇的細胞本身狀態不好，已經老化，失去貼附性，建議啟用新的保種細胞。如果細胞比較珍貴或沒有備份細胞，可嘗試將不貼壁細胞收集離心，再用 PBS 將沉淀清洗一遍，離心后的沉淀加入胰酶重新消化接種，同時提高血清濃度到 15%~20%。復蘇后是否成功，根據接種后細胞的形態和貼壁率而定，倘若第二天有95%以上的細胞貼壁，且形態良好，則說明復蘇成功。復蘇接種的時候，采用較高的接種密度，使細胞的整體密度高一些，有利于細胞的生長。